科创板与新三板在上市定位、上市门槛、注册审核流程、投资要求、交易方式、信息披露和退市监管上都存在显著差别。总的来看，科创板上市定位明确，注册审核全流程电子化公开，上市门槛和投资要求的设置上综合平衡风险和流动性，拥有系统完善的信披机制和退市制度；而新三板作为场外试点注册制的板块，上市定位并不清晰，注册审核流程十分简易，上市门槛过于宽松，再叠加投资要求上的过高设置，缺少体系完备且执行到位的信息披露和退市制度、导致市场流动性匮乏。
上市定位方面，科创板是首个场内试点注册制的增量板块，定位于服务面向世界科技前沿、面向经济主战场、面向国家重大需求，主要依靠核心技术开展生产经营，具有稳定的商业模式，市场认可度高，具有较强成长性的企业，重点支持新一代信息技术、高端装备、新材料、新能源、节能环保以及生物医药等六大领域。而新三板属于场外市场，其成立之初主要服务北京中关村的高科技企业。2014年1月24日，新三板正式宣告成为全国性的证券交易市场，至此，新三板的上市定位已不仅仅局限于高科技企业。
注册审核流程方面，科创板试点注册制审核进度全流程电子化公开，企业需要经历提交申请、受理、问询、上会、注册等多个环节，尤其是多轮问询的公开，在“问出一家真公司”的同时，帮助投资者更全面地了解拟上市公司；而新三板的注册审核流程则明显更加简易宽松，挂牌流程相对简单，企业向全国中小企业股份转让有限公司(下称“全国股转公司”)提交挂牌申请材料后，全国股转公司有针对性地提出问询，企业和项目组反馈之后，若无问题，在收到全国股转公司的“无异议函”后即可办理股权登记和简称、代码分配。
上市门槛方面，针对不同性质的企业，科创板设置了不同的上市标准。如针对境内同股同权的企业，设置了五套以市值为核心的上市标准，具体指标涉及市值、营收、净利、现金流以及研发费用等多个指标的多种组合，且随着企业经营稳定性的降低，对市值等指标的要求就越高。相比之下，新三板的挂牌要求则宽松得多，多为规范性的定性要求，如果仅仅是挂牌，硬性量化指标仅需经营满两年。过低的挂牌门槛，导致新三板企业良莠不齐，多数质地一般。
投资要求方面，科创板对个人投资者设置了2年以上投资经验和50万元总资产的投资门槛，并没有特别针对机构投资者设置相应要求，而新三板对个人和机构投资者均设定了较高的门槛，其中个人新三板开户条件是2年以上证券投资经验和投资者本人名下前一交易日日终证券类资产市值在500万元人民币以上，明显高于科创板。过高的投资者门槛，使得一般只有规模较大的投资者才能参与新三板交易。
交易方式上，科创板的交易方式更加多样，除了竞价方式和大宗交易等方式外，科创板还新增了盘后固定价格交易方式，成为盘中连续交易的有效补充。而新三板以做市交易为主，以促进市场流动性。同时，新三板企业挂牌时无公开发行环节，挂牌初期多数企业股票成交低迷。
信披和退市监管上，科创板建立了系统完善的信息披露机制以及退市制度，其中退市制度总体比主板更为严格，退市情形更多、也更加彻底。而新三板虽然挂牌公司所有拟披露的信息都需要经过主办券商的事前审查，但并没有对后者在此环节中担负的责任作详细规定，信披违规处罚力度也较轻。同时，新三板也没有完备而严格的退市制度，导致其新陈代谢并不顺畅。
